新冠病毒与生物安全实验室探讨--苏州大学医学部张乐帅教授

  新冠病毒疫情到今天为止，已经波及到世界各地，目前除中国之外的感染人数上数十万。因此，新冠病毒的传染性极强，毒性也远比普通流感强很多。

  新冠病毒疫情到今天为止，已经波及到世界各地，目前除中国之外的感染人数已达数十万。因此，新冠病毒的传染性极强，毒性也远比普通流感强很多。新冠病毒的传染性和毒性为何如此之强？生物安全实验室等级规划区分又是怎样的？本文，来自

  张乐帅博士，现为放射医学与辐射防护国家重点实验室、苏州大学医学部放射医学与防护学院教授、美国资质认证毒理学家、欧洲注册毒理学家、英国注册毒理学家。2002年及2005年分获华东理工大学生物化学学士及硕士学位，并于中科院上海生化细胞所联合硕士培养；后赴美学习，2010年获美国北卡州立大学博士学位；2010-2012年于美国食品药物管理局开展药物毒理学研究，并参加进行药审培训；2012年起于美国堪萨斯州立大学担任研究助理教授，开展食品毒理学、纳米毒理学研究；2014年聘为苏州大学放射医学与防护学院教授。目前从事基于三维肝微组织的纳米毒理学以及纳米肿瘤免疫学的研究活动。截止目前，共发表文章40余篇，论文引用1500余次，获得国自然面上基金3项与青年基金1项。

  新冠病毒的传染性和毒性为何如此之强？研究之后发现，病毒表面的spike（S）蛋白有一段受体结合区（RBD），此区域和2002年爆发的SARS病毒S蛋白对应序列非常接近，因此人们一开始就猜测新冠病毒可能与人体细胞上的一种叫做血管紧张素转换酶2(ACE2)结合而入侵细胞【1】。进一步研究之后发现，新冠病毒S蛋白RBD区域相比于SARS病毒产生了系列突变，使它与细胞表面ACE2的结合能力灵活性更好而强劲【2】;更有学者发现，冠状病毒的侵染还能进一步提升ACE2的表达【3】。因此，新冠病毒被认为能经由病毒携带者以间接接触或气溶胶形式传染给健康人，并与人类肺泡II型细胞ACE2蛋白的结合，肆无忌惮的进攻肺部。紧接着，为对抗新冠病毒，人体产生了过度免疫反应（细胞因子风暴），炎症的爆发使肺部产生并充满大量的黏液质（有的人觉得是死亡细胞DNA释放所致），病人因此呼吸变得困难而成为重症患者。新冠病毒还能游走到人体深处，变本加厉的侵犯同样高表达ACE2的心脏、肾、睾丸等器官，提示这些器官也有一定可能会受到新冠病毒的侵袭，因此导致心血管毒性、肾毒性及生殖毒性等系列问题【4,5】。Blablabla的说了大半天新冠病毒的传染性和毒性机理，吃瓜同事们有没有突然意识到，这研究的对象可是病毒呢！如果科研人员在常规生物实验室做病毒相关的细胞或动物实验，病毒就能在不知不觉中传染给他们，并在体内大量组装成具有高度活性的子代病毒。那么，以上针对冠状病毒的研究应该在哪里进行呢？大家自然就想到了石正丽教授团队所在的中国科学院武汉病毒研究所，他们进行的高度危害性的病毒实验，是需要在那称为P4级别的国家生物安全实验室（NBL）中进行的。P4实验室又是什么呢？在这里，作者将和大家聊聊生物安全实验室的基本概念、总体介绍、建造标准和技术规范，及相应的法律和法规支持，以便各位深入理解病毒研究过程的高标准严要求，并通过此文建议我校可考虑建立P3实验室，以满足我国生物安全研究的国家战略需求。

  病原微生物的毒性差别很大，因此要采取对应的保护措施；根据对所操作的病原微生物的特点，将实验室生物安全防护水平分为一到四级（P1-P4）；官方的定义可详见《病原微生物实验室生物安全管理条例》【6】；有关四个级别的生物安全实验室的总结，可详见下表【7】。在这里，作者将用通俗的语句对四个级别的生物安全实验室分别阐述。在这四个级别中，P1防护水平是最低的，所操作的微生物在这种普通实验室中正常情况下不会导致科研人员生病，比如一些非感染性的细菌，包括再熟悉不过的E. coli大肠杆菌；这样的细菌在实验过程中用手套和护眼罩防护、实验做完后用肥皂洗手即可。

  P2级就要注意一点了，所操作的病原微生物往往对科研人员造成轻微的疾病，比如甲乙丙型肝炎、麻疹病毒、抗药性金黄色葡萄球菌。P2级别下操作病毒相应的保护措施会比P1级来得严格，比如只能是经过培训的人员才能进出、必须在生物安全柜中操作样品、最好用二级生物安全柜而防止因操作导致喷雾形式的污染。相比之下，P3和P4级别下操作的病毒对象，都会引起科研人员严重的疾病，因此防护的要求是非常高的；在这里对这两个级别进行更为详细的描述。

  值得一提的是，美国疾控中心也将艾滋病病毒（HIV）归类在P2实验室中研究和管理【8】。你很有可能会说，这种病毒致病性也是非常让人生畏的，但为什么能允许在级别较低的P2实验室中研究，是不是太危险了？大家都知道，HIV传染途径主要是通过性传播和血液传播，但不会通过气溶胶发生传染。目前认为，普通接触很难传染艾滋病，因此按照这一个理论，HIV应归类在P2级实验室中操作。具体而言，美国疾控中心有关《微生物与生物医学实验室的生物安全》第五版【8】中详细对艾滋病病毒的研究应对有非常明确的解释：“如果要生产实验室研究所需的HIV，或者浓缩HIV，或在研究过程中会产生HIV液滴或气溶胶，则整个活动应在P2实验室中进行，但用P3的实践规范来管理。若需要获得更大规模的病毒量或者浓缩，则采用P3实验室规范管理模式做相关操作及防护。”简单的说，如果要研究HIV，则至少要在P2实验室中进行超严格的管理，但最好在P3实验室中进行。

  那么，P3实验室又是怎样的呢？P3生物安全实验室中研究的病原微生物具有高度危害性，传染给科研人能引起严重甚至致死的疾病，但所幸目前已经有预防和治疗的方法；相关的病毒包括臭名昭著的炭疽杆菌、结核杆菌、伤寒杆菌等；这些病菌会引起严重的疾病，但是已经相应抗生素可治，也有疫苗可防。截止目前，我国已有近50家机构建立了P3实验室，大部分在各个省直辖市的出入境检验检疫局以及疾控中心，而中国疾病预防控制中心也针对禽流感、病毒性出血热、病毒性脑炎、艾滋病病毒、SARS以及不明疾病建立了十多个P3实验室；除此以外，在高校中复旦大学、浙江大学、武汉大学、中山大学、扬州大学、华南农业大学、华中农业大学、中国医科大学都建立有P3实验室。2020年2月14日，习在主持召开中央全面深化改革委员会第十二次会议中提到“把生物安全纳入国家安全体系，要尽快推动出台生物安全法，加快构建国家生物安全法律和法规体系、制度保障体系”【9】。因此，可见在未来两三年内，将会有更多疾控中心及检验检疫部门之外的高校、科研院所研究机构P3生物安全实验室出现，以满足国家生物安全的战略需求。

  相比之下，P4级别生物安全实验室中所处理的病原体不仅仅具备高传染性，还无药可治、无（疫）苗可防，比如刚果出血热、埃博拉病毒；天花病毒虽然有药可治、有苗可防，但由于其高烈性的传染能力，人们依然选择尽可能在P4实验室中研究。那么在这里，我们不得已提到SARS冠状病毒的研究治疗史，其当年的治疗方法主要是使用大量的激素，但导致了病人的股骨头坏死的问题，因此激素疗法并非为可靠的治疗方法；另外，我国自制研发的SARS疫苗仅仅经历了一期临床试验就戛然而止，其仅是在受试者中观察到了抗体【10】，在此以后病毒不再传播，疫苗也就失去了商业意义，企业没有动力再投入。由此能够判断，SARS病毒的研究即使是现在，也应置于P4实验室中进行。然而，我国在2003年虽然有数个所谓的P3实验室，但因为缺乏安全实验室的评价标准，包括了硬件的重大缺失、软件的国内外差距、安全意识淡漠、缺乏系统培训、没有管理体系等问题，导致科研人员只能在相对落后的P3实验室研究SARS病毒——这就是SARS被归类于在P3实验室中操作的历史原因。甚至在2003年前，连见过P4实验室结构的人都没有，这样一些问题导致了国家决心建立生物安全实验室标准和法规，以推动更高层级的病毒研究。

  这次新冠病毒开展的研究所需的生物安全实验室的级别，国家也予以了规定。国家卫生健康委办公厅早在本年1月23日发布了《新冠病毒实验室生物安全指南》第二版，强调病毒培养、动物感染试验应在P3实验室做，未经培养的感染材料操作应当在P2实验室做，采用P3实验室规范管理模式做相关操作及防护，对于灭活材料的操作可在P2实验室中进行，而分子克隆等不含致病性活病毒的其他操作，可以在P1实验室做【11】。一般来说，相应等级实验室需要报经国家卫生健康委批准，取得开展相应活动的资质，才能开展针对某种病毒的研究。

  由于我国P3生物安全实验室较多，部分省直辖市疾控中心和检验检疫部门已申请并在运营状态，可有较多机会参观；但是P4实验室最为高端，其与P3有一定相似度，而建设与管理更为严格。下面就以武汉病毒所为例，在P4实验室中是个什么体验。武汉病毒所P4实验室共3000多平方米，其分为四层：底层是污水处理池和设备、制氧设施；二层是核心实验区，包括3个细胞实验室、2个动物实验室、1个解剖间、1个菌毒种保存间；三层为线路管道，如果坏了能够直接进行检修；四层是过滤送排风、恒温恒湿空调保障系统。它的整个建造工艺与技术装备由法国输出，整个工程耗时十余年；中法签署的协议内包括人员培训，科研人员大多数都会赴法国的实验室接受培训，并获得法国BSL-4使用许可证书。

  P4实验室有一层一层的负压装置，气压向内逐层递减，保证了烈性病原不会向外扩散；整个实验室的密封性极为良好，极少留有缝隙；有关电力也是优先保证P4实验室的供电，在紧急状况下可由发电机自行发电，从而充分保证了实验室安全；作为一个P4级别的实验室，实验室的一切都受到24小时的监控。核心实验区大约300平方米，外部有环形走廊，其中间是真正进行病毒研究的实验室。外部与核心实验室由大大的玻璃窗分隔开；核心实验室内设备很特殊，有专门的二级生物安全柜和培养箱等，还有含有特制键盘、电话和显微镜；在与外间控制室里，工作人员和来交流的科学家是不需要穿防护服的，他们能够实时观看研究图片，并和实验室里的研究人员交流，还可以远程控制显微镜。相关的内部结构可见下图【12】：

  进入P4实验室的人员都一定要进行各类实验活动的演练、熟悉实验环境与设备操作，开展各类意外事故的演练，经过相当严格的培训（如穿脱防护服），通过考核拿到证书才可以获得上岗资格。核心区任何相邻的门之间都有自动连锁装置，防止两个相邻的门被同时打开，从而避免室内空气的流通。进入实验室需要耗费大概15到20分钟时间，研究人员两人一组在更衣间脱去所有衣服，进入气闸室淋浴消毒完毕，穿上一次性内衣后，再去穿防护服。防护服不是普通的衣服，防护服头部是透明的充气罩，外表为白色，有点像宇航服，只不过它是用来防止病毒感染的；这里要给防护服加压，确保其没有泄露才能穿；防护服下端连接着一条直径2cm的天蓝色呼吸软管，管线另一端悬挂连接在天花板上，与供气导管连接，其会向防护服内提供新鲜呼吸空气，防护服内的正压状态可以让防护服离开供气导管的两分钟时间内，还能持续内部工作人员的呼吸供气，也便于工作人员移动时更换供气导管。在穿戴好防护服之后，即可进入操作间，也就是热区（Hot zone）。在P4实验室中做实验，多处设有呼吸管，因此走到哪里，呼吸管就要换到哪里；研究人员用移液器把病毒样本取出来，在做这种高危操作的时候，除了操作人，还必须有另外一个人在旁监督。

  在实验完毕后，人员穿戴的防护服先要冲一个化学浴，杀灭可能沾染的病毒，然后脱去防护服做正常淋浴后，方可出去，并且人需要视情况做隔离一周；实验室内的废气需要经过特殊处理，其经过两级高效过滤器处理后进行排放；已被感染的材料和被污染的器具等固体污染物，要经过双扉灭菌器高压蒸汽灭菌处理，打包装袋，运到专业医疗废弃物公司做无害化焚烧处理；运送过程由专车托运，全程与实验室保持信息反馈；液体则要经密闭管道收集后，经高温灭菌处理后无害化排放，以保证彻底杀灭病原。这样，人员、废气、废液、废料都在出P4实验室之前都会进行最严格的的处理和运输，完全杜绝了病毒侵染和传播。

  要建成一个真正可靠而先进的生物安全实验室，国家需要的是相应的设计原则、建造技术、操作规范、管理制度。继2002年发生非典后，国家认监委与认可中心在2004年组织起草并发布了国家标准《实验室生物安全通用要求》（已在2008年更新）【13】。2005年，武汉大学获得了首张P3生物安全实验室的国家认可书；在此之后，我国的更多P3生物安全实验室如春笋般出现了，直到中科院武汉病毒所和武汉市政府合作建设，在2018年1月运行了P4实验室——这是中国首个生物安全P4实验室，也被誉为病毒学研究领域的“航空母舰”。目前，全球公开拥有P4实验室的仅有法国、加拿大、德国、澳大利亚、美国、英国、加蓬（法国巴斯德所）、瑞典和南非等国，其中，美国有13家P4级的生物安全实验室

  。虽说我国目前仅有一家P4实验室，但其推出可以极大促进我国P4实验室的广泛建立。近年来，国家科学技术部又进一步修改了《高等级病原微生物实验室建设审查办法》【15】，从而完善生物安全实验室的审查颁证的过程要求，为实验室的建设提供了参考。

  对于我国大多数高校的科学研究，P3级别生物安全实验室就能满足规定的要求，一般依据《生物安全实验室建筑技术规范》来规划和执行建筑方案【16】；它比P2实验室在建设要求方面更加特殊。比如屏障系统中必须有二级屏障系统，有更严格的负压要求；有最好为独立建筑的要求；有相应的实验室高度、人流路线、进出口的要求；在装修方面需要密闭和良好标识、抗震的要求；送排风方面，有对全新风系统、最好为III级生物安全柜、三级过滤的要求；给排水方面，有管道明敷和明确标识、地漏深度、排水消毒的要求；电气方面，需要各种标识、按钮清晰明确，需要有报警装置、人工紧急设定装置；消防方面为二级耐火级别，但需要保证尽快让人疏散却不能让病原体泄露的原则来建设。具体如下：屏障与环境要求：P3实验室必须有一级屏障（操作人员与操作对象之间的隔离）和二级屏障系统（实验室与外部的隔离），而P2只是建议最好都有。对二级屏障的要求而言，P3实验室相比于P2实验室更加严格，比如：外界大体的整体负压会更严格（-80与-30Pa），洁净度要求差不多，换气次数多一点（15次/h与12次/h）、房间不能有缝隙并在负压状态下只能有10%房间体积/h的空气泄漏（P2没这个要求）。P3实验室还有对实验室其他房间（如缓冲间、走廊、准备间、更衣间、淋浴间、化学淋浴间、污水处理、尸体处理）也有洁净度、换气次数、负压差、亮度的要求。

  建筑要求：P3实验室可以共用建筑物，应自成一区且有排风间距，而P2只需要有个门隔即可；但P3如果是b2分类（如研究经空气传染病毒），则需要单独建筑；有实验室高度、清晰的人流路线、安全通道/紧急出口、单独的围护结构、二级实验室没有的灭菌器、生物安全柜和负压解剖台在排风口附近。

  装修要求：P3有对踢脚线、地/墙材料、无外窗、防止虫鼠出逃、门自动关闭、气密、顶部无检修口、入口多个标识、特殊设防的抗震能力、混凝土结构、对吊顶荷载的要求。

  空调与通风净化要求：最好用带层流的III级生物安全柜，需要全新风系统、紧密的排风阀门，并能够有送排风的调节能力，能对空滤做消毒检漏；送风系统有三级空气过滤要求，并防雨防虫鼠，且高出地面2.5m，需要有备用的送风机；排风系统中，需要过滤后再排放，还需要备用排风机；需要有从污染低向污染高的气流方向；空调部件耐消毒气体的腐蚀、过滤器要防潮。

  给水排水与气体供应：最好少敷设管道，并明敷让人见到；有很好的密封性、耐腐蚀、耐压耐温，不漏等普通要求。给水方面而言，水要防止倒流、要有断流水箱、进入主实验室前应有检修和止回阀、洗手位置、紧急冲眼装置、专门的淋浴装置、给水管的颜色。P3的排水方面，排水水管用不锈钢并要明敷，设置地漏和深度要求，并含消毒液；独立的排水支管、排水需要灭菌处理、活毒需要高温灭菌方式；辅助区域的水也要做监测，确保排放前达到一定的要求。气体供应方面：真空装置应有防止装置内部被污染的措施。

  电气：按照一级负荷供电，需要设置不间断电源和自备发电设备作为应急电源，配电箱在外面；电管线应用金属材料，并另加套管。照明用吸顶式密闭洁净灯并能防水，应有不少于30min的紧急照明和疏散标志，还有各个显示灯。自动控制方面，需要有重要参数报警和一般参数报警灯、应设置紧急报警按钮、送排风运转标志及保护设施、送排风压差传感器、风压差检测装置和报警、送排风的连锁、空调自动和手动控制，还有门禁系统、门的互锁系统、互锁紧急解除装置、监控设备、通信设备。

  消防：耐火等级不可低于二级，吊顶材料耐火性能与隔墙同，防火门为甲级防火门，不能设置自动喷水灭火系统，送排风系统可不设置防火阀，防火设计应以保证人员疏散、防止病原微生物疏散为原则，且火能从内部控制。

  新冠病毒目前表现出很强的气溶胶传染性和中等致死率（2%），更严重的是，大量的无症状患者会使科研人员感染后表现出长时不发病；因此，在研究新冠病毒过程中，要格外小心其感染科研人员。目前新冠病毒在尚无药可治、无苗可防的情况下，因机制研究和药物开发的需求，武汉病毒所P4实验室进行了较为成功的体外试验，发现瑞德西韦90%病毒抑制率对应的浓度为1.75uM，而氯喹在6.90uM【17】；而李兰娟院士在浙江P3实验室中，也成功分离到8株病毒并进行疫苗开发，并称阿比多尔在10~30uM浓度下能有效抑制冠状病毒达到60倍，而达芦那韦在300uM浓度下，能显著抑制病毒复制，抑制效率达280倍【18】。这些研究结果，无疑是在P2实验室没办法完成的。苏州大学医学部目前有P2生物安全实验室，可考虑在独墅湖校区二期中以独栋楼的形式来建立P3实验室，其不仅是为了与其他一流高校肩并肩前进，更是为了用我们的实际行动响应国家号召，在更加标准的生物安全环境下，充分将病原体研究透彻，从而确保人民群众生命安全和身体健康。更详尽的有关生物安全实验室的国际指南还有世界卫生组织早在2004年发表的《实验室生物安全手册》【19】，供各位参考。

  6. 《病原微生物实验室生物安全管理条例》. 2004年11月12日中华人民共和国国务院令第424号公布，2018年3月修正。

  9. 习：把生物安全纳入国家安全体系 尽快推动出台生物安全法. 发布时间：2020-02-14 21:16:52来源：央视新闻

  11. 国家卫生健康委办公厅关于印发新冠病毒实验室生物安全指南（第二版）的通知. 国家卫生健康委办公厅. 2020年1月23日.

  15. 中华人民共和国科学技术部令第18号：关于修改《高等级病原微生物实验室建设审查办法》的决定. 2018年7月16日.

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